CRISPR gRNAライブラリを使用したゲノムワイドスクリーニングにご利用いただける次世代シーケンス解析サービスです。
gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、Illumina HiSeqを使用したディープシーケンス、gRNAのリードカウントを行います。

サービス内容

gRNA領域のPCR産物をご提供いただき、ライブラリ調製、HiSeqデータ取得、gRNAのリードカウントを実施いたします。
比較対象のサンプルがある場合は、比較テーブル作成(オプション)も承ります。

gRNA領域のPCR
(お客様にて実施)

ライブラリ作成

HiSeqシーケンスデータ取得

gRNAのリードカウント

比較テーブル作成

 *有料オプション

解析プラン

ご希望のリード数に応じて、3種類のデータ取得プランよりお選びいただけます。
※リード数とカバレッジの関係については、下記「リード数について」をご参照ください。
※単位:円 (税別)
作業内容(全プラン共通) データ取得プラン 取得リード数(/検体) 価格(/検体)
・ライブラリ調製
・HiSeq 100bp Paired-End
・gRNAのリードカウント
Min-Depth 500万リードペア 80,000
Mid-Depth 3,000万リードペア 160,000
High-Depth 6,000万リードペア 250,000

リード数とカバレッジ

ライブラリに含まれるgRNAの種類数、および、必要なカバレッジ(リード数/gRNA)に基づき、取得リード数をご選択いただけます。
データ取得プラン 1検体あたりのリード数 カバレッジ
(例)gRNAが12万種類の場合
Min-Depth 500万リードペア / 検体 ×40 / gRNA
Mid-Depth 3,000万リードペア / 検体 ×250 / gRNA
High-Depth 6,000万リードペア / 検体 ×500 / gRNA

納品データ

シーケンスで得られたリード配列からgRNA領域を切り出し、各gRNAのリード数を集計します。
【gRNAのリードカウントテーブル】
gRNA ID gRNA Sequence SampleA
Count
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG 213
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG 294
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG 35

比較テーブル作成(有料オプション)

各サンプルで算出されたgRNAカウント情報にもとづき、ControlサンプルとTreatサンプルのカウント比較テーブルを作成します。
また、gRNAのエンリッチ情報をもとに、gRNAがターゲットとする遺伝子ごとのnegative/positive selection情報も算出します。
●納品データ例
【gRNAのカウント比較テーブル】
gRNA ID SampleA
(Control)
SampleB
(Control)
SampleC
(Treat)
SampleD
(Treat)
LOG2FC p_value FDR High in
Treat
ID_0001 213 274 883 175 1.12 0.9996 0.00699 FALSE
ID_0002 294 412 1554 1891 2.29 0.0000 0.00000 TRUE
ID_0003 421 368 566 759 0.75 0.9995 0.00726 FALSE

【遺伝子のnegative/positive selection情報】
Gene negative selection positive selection
p_value FDR Rank p_value FDR Rank
RPS5 0.000 0.000236 1 1.000 1.000 19147
YARS 0.000 0.000236 2 1.000 1.000 19146
GTF2B 0.000 0.000236 3 1.000 1.000 19145
NRF1 0.000 0.000236 4 1.000 1.000 19144
NLE1 0.000 0.000236 5 1.000 1.000 19143

●価格
※単位:円 (税別)
作業内容 価格
比較テーブル作成 50,000/テーブル

ご用意いただくもの

●サンプル: gRNA領域のPCR産物
下記@〜Cの条件を必ずご確認ください。
リンカー配列 gRNAを含むインサート配列 リンカー配列
* A参照 * B参照 * A参照
@ご提供いただくPCR産物の量は5ng(0.2ng/μL)以上を目安にご用意ください。
A弊社指定のリンカー配列(※配列はお問い合わせください)を付加したプライマーでPCRを行って頂き、リンカー配列の付いたPCR産物をご提供ください。
BgRNA領域を含むPCR領域(リンカー配列を除くインサートサイズ)は100〜150bp程度としてください。
但し、gRNA領域がPCR産物の5'もしくは3'末端から80bp以内に含まれる場合には、インサートサイズは100〜500bp程度でも構いません。
CPCR産物の精製を行ってください。

●参照データ: gRNAリスト
gRNAのID、配列、対象Geneの対応表をご提供ください。
データ解析(gRNAのリードカウント)で使用いたします。
【gRNAリスト例】
gRNA ID gRNA配列 Gene
ID_0001 AAATACAAACAACTCTGAG GeneA
ID_0002 GAAGTGTCCCAGGGCGAGG GeneB
ID_0003 ACTCTATCACATCACACTG GeneC

よくある質問と回答

Q:コントロールサンプルは必要ですか。
A:スクリーニング前後でgRNAのカウント数を比較するために、スクリーニング前(gRNAエンリッチ前)のコントロールサンプルが必要になります。コントロールサンプルがない場合でも、各検体のgRNAリードカウントを行うことは可能です。

Q:コントロールにはどのようなサンプルが使用されますか。
A:コントロールサンプルには、トランスフェクション前のgRNAライブラリ、または、トランスフェクション後の培養細胞のday0(未処理)サンプルなどが使用されます。

Q:レプリケートは必要ですか。
A:gRNAのエンリッチ状況について、信頼性のある統計情報を算出するためには、レプリケートサンプルをご用意いただくことを推奨いたします。レプリケートが無い場合でも、解析を行うことは可能です。

Q:カバレッジ(Depth)はどのように決めたら良いですか。
A:一般的に、×100〜500カバレッジ/gRNA程度のDepthが推奨されております。ライブラリに含まれるgRNAの種類数、および、ご希望のカバレッジ(リード数/gRNA)に基づき、取得データ量をご選択ください。例えば、12万種類のgRNAライブラリに対して平均250カバレッジとなるデータ量は、12万×250=3000万リードペア(Mid-Depthプラン)となります。

Q:PCR、精製について推奨の方法はありますか。
A:本解析は、「16S Metagenomic Sequencing Library Preparation (Illumina)」に沿って実施いたします。PCRおよび精製の方法につきましてはこちらのプロトコルをご参考いただき、詳細はお問い合わせください。
北海道システム・サイエンス株式会社
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